Elettroforesi: tipi, applicazioni

L’elettroforesi si applica a particelle cariche in una soluzione elettrolitica e trova le  più importanti applicazioni nell’analisi di sostanze complesse colloidali cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Successivamente il termine è stato esteso a tutti quei fenomeni che coinvolgono la migrazione di particelle cariche in un mezzo per la presenza di un campo elettrico, specie se il fenomeno elettroforetico è sfruttato a fine di separazione.

L’elettroforesi si applica a qualunque particella carica in una soluzione elettrolitica. Tuttavia questa tecnica trova le  più importanti applicazioni nell’analisi di sostanze complesse quali le proteine e altre molecole di interesse biochimico.

Applicazioni

Sono analizzati elettroforeticamente anche composti più semplici come peptidi, amminoacidi, zuccheri, purine ed anche ioni inorganici. Le sostanze che sono separate più frequentemente con tale tecnica sono le proteine. La molecola di una proteina è anfotera e in soluzione subisce l’equilibrio:

⁺NH₃-R-COO^– + OH^– ⇄ NH₂-R-COO^– + H₂O

⁺NH₃-R-COO^– + H⁺  ⇄ ⁺NH₃-R-COOH

Come tutti gli anfoteri essa ha un suo punto isoelettrico definito come il valore di pH a cui la concentrazione della forma acida è uguale a quella della forma basica. La molecola al punto isoelettrico può essere rappresentata dalla forma ⁺NH₃-R-COO^– la quale non tende a migrare verso nessuno dei due poli.

La molecola proteica in una soluzione colloidale elettrolitica può essere rappresentata in scala microscopica come una fase diversa da quella del solvente. Al confine delle due fasi, proteine-solvente, si forma un doppio strato elettrico e la parte proteica assume il segno positivo o negativo a seconda che il pH della soluzione si trovi a valori più bassi o più alti del suo punto isoelettrico.

Il valore del pH assume dunque un ruolo decisivo nel comportamento elettroforetico della molecola; le soluzioni per elettroforesi sono infatti tutte soluzioni tampone di notevole capacità tamponante. Anche la forza ionica della soluzione, che è una misura della concentrazione totale degli ioni presenti in essa, che influenza lo spessore del doppio strato e, quindi, il potenziale zeta, ha importanza e in genere il suo valore, che, come è noto, è dato dalla semisomma di tutte le concentrazioni di tutti gli ioni presenti in soluzione, è considerato ottimale quando è compreso tra 0.06 e 0.1.

Tipi di elettroforesi

Dal punto di vista tecnico si possono distinguere due tipi di elettroforesi:

• Libera o a interfase mobile
• Di zona

Elettroforesi libera

L’elettroforesi libera nella sua forma più semplice è effettuata in un tubo ad U che in un braccio è riempito dalla soluzione macromolecolare, sciolta nel tampone, e nell’altro con la soluzione tampone. Gli elettrodi sono posti alle due estremità del tubo a U.

Applicando una differenza di potenziale agli elettrodi si ha la migrazione differenziata dei vari costituenti della miscela da analizzare e dopo un certo tempo si possono distinguere diversi strati separati da superfici di separazione dovute alla diversità dell’indice di rifrazione delle diverse soluzioni che si sono formate.

L’apparecchiatura classica per questo tipo di elettroforesi è quella dovuta a Arne Tiselius.

I tre comparti servono per formare strati netti di separazione fra proteina e soluzione tampone, in modo da ottenere superfici di separazione ben definite. Nella parte bassa del tubo è posta la soluzione concentrata di proteina, nel tubo di sinistra il tampone e in quello di destra ancora proteine.

Così stratificate le soluzioni si fanno slittare i tre comparti in modo da mettere in comunicazione le soluzioni tra loro.  L’eccesso di soluzione tampone contenuta nel primo comparto  assicura il collegamento elettrico agli elettrodi che sono tenuti lontani dal tubo di analisi in modo da evitare qualsiasi interferenza da parte di fenomeni elettrolitici che si possono verificare.

L’elettroforesi a superficie di separazione mobile presenta diversi inconvenienti:

–  Si ottiene in genere un arricchimento delle sostanze, ma solo di rado una separazione totale delle stesse

–  Devono essere impiegate notevoli quantità di campioni

–  Risulta difficile il recupero dei campioni separati

–  La rivelazione, basata su metodi ottici è difficile

Elettroforesi di zona

L’elettroforesi di zona è molto simile alla cromatografia. Essa impiega colonne riempite di un supporto quasi inerte come agar, amido, cellulosa, resine poliviniliche. Il supporto è imbibito della soluzione tampone del pH desiderato e il campione è inserito in cima alla colonna ai cui estremi sono inseriti gli elettrodi. Un altro metodo, detto a flusso continuo su carta impiega un foglio di carta da filtro posto verticalmente nel quale la soluzione tampone fluisce come in una normale cromatografia su carta. I vari componenti si scostano più o meno dalla verticale a seconda della loro mobilità elettroforetica.

Quest’ultima è definita come la distanza percorsa dalla particella in un secondo quando il campo elettrico è di 1 V/cm; essa non dipende dalla massa della particella ma dalla massa e dal numero di cariche che essa porta misurata sul piano di slittamento degli strati d’acqua non solidali con la molecola.

Le molecole proteiche hanno una mobilità elettroforetica che è dello stesso ordine di grandezza di quella dello ionie Na⁺ e degli amminoacidi poiché la densità di carica è su di esse molto elevata per la presenza dei gruppi –COO^– o NH₃⁺. Tale densità di carica varia per gli anfoteri con il pH del mezzo in cui si trovano. Questa proprietà è sfruttata per misurare il punto isoelettrico facendo variare il pH regolarmente lungo l’asse di cammino della particella. Quando essa giunge in una zona in cui il pH è quello corrispondente al pH isoelettrico la proteina si ferma.

Una difficoltà dell’elettroforesi consiste nella differenza di potenziale da applicare: se essa è bassa fino a 20 V, l’analisi richiede tempi lunghi che possono arrivare a giorni, mentre se si vuole ottenere una maggiore quantità di analisi occorre aumentare il voltaggio applicato che può giungere fino a 350 V; in questo caso, però si ha un notevole sviluppo di calore che può danneggiare i prodotti biologici e far evaporare il solvente. Occorre quindi impiegare sistemi di raffreddamento e operare in grandi recipienti che creino un ambiente saturo di solvente