Reattivo di Kovac: determinazione dell’indolo
Il reattivo di Kovac è utilizzato per la determinazione della presenza dell’indolo che è uno dei prodotti finali del triptofano a seguito di ossidazione batterica. Il fisico ungherese Nicholas Kovacs pubblicò nel 1928 questa sua scoperta
Il triptofano è un amminoacido dalla cui ossidazione si formano principalmente acido piruvico, ammoniaca e indolo pertanto la presenza di quest’ultimo ne indica la degradazione. La formazione dell’indolo è quindi una caratteristica importante per l’identificazione di molte specie di microrganismi ed è particolarmente utile per distinguere Escherichia coli (positiva) da altri membri del gruppo come Klebsiella, Enterobacter Hafnia, Serratia in maggioranza negativi.
Reazione
La triptofanasi nota anche come triptofano indol-liasi è un enzima batterico appartenente alla classe delle liasi che catalizza la reazione di degradazione dell’indolo tramite α,β-eliminazione e β -meccanismi di sostituzione. Pertanto i batteri che possiedono l’enzima triptofanasi sono in grado di idrolizzare e deaminare il triptofano secondo la reazione
Composizione del reattivo di Kovac
Il reattivo di Kovac è costituito da HCl al 25%, 3-metil-1-butanolo noto come alcol isoamilico al 75% e p-dimetilaminobenzaldeide contenente un gruppo amminico terziario e un gruppo aldeidico al 5% m%V. La soluzione di conserva a 4°C.
Quando l’indolo si combina con il reagente di Kovac la soluzione vira dal giallo al rosso porpora dovuto alla sua reazione con il gruppo aldeidico della p-dimetilamminobenzaldeide. Poiché l’alcol amilico non è solubile in acqua, la colorazione rossa si formerà in uno strato oleoso nella parte superiore del brodo di coltura
Interpretazione dei risultati
Il test si considera positivo a seguito dello sviluppo di un colore rosso all’ interfaccia entro 30 secondi e negativo se non si osserva cambiamento di colore.
Potrebbe verificarsi un risultato variabile a causa di formazione di scatolo, un composto metilato che può essere un precursore della formazione di indolo
