Nucleasi
Le nucleasi sono enzimi pancreatici, unitamente a lipasi, proteasi e amilasi, che scindono i legami fosfodiesterici nei polinucleotidi e pertanto hanno la capacità di degradare il DNA o l’RNA. L’RNA e il DNA presentano solo due tipi di legami fosfodiesterici per la scissione, 5′ o 3′ di un fosfato, e la chimica fondamentale è la sostituzione nucleofila SN2 detta anche bimolecolare.
Le nucleasi del DNA, abbreviate comunemente DNAasi, svolgono un ruolo cruciale in vari processi di riparazione del DNA, che coinvolgono la replicazione del DNA e la riparazione della rottura del doppio filamento al fine di mantenere l’integrità del genoma, per preparare le estremità del DNA per la ricombinazione.
Le ribonucleasi, abbreviate comunemente RNasi, sono delle nucleasi che catalizzano l’idrolisi dell’acido ribonucleico e degradano anche l’RNA per rimuovere gli mRNA difettosi che non possono essere tradotti, per regolare l’espressione genetica
Tuttavia, le strutture e i meccanismi catalitici delle nucleasi di RNA e DNA sono molto vari e complessi. Le nucleasi possono essere costituite da proteine o da RNA e utilizzano acqua, desossiribosio, fosfato inorganico o le catene laterali di serina, tirosina o istidina come nucleofilo. La catalisi può richiedere o meno ioni metallici e inoltre, le attività della nucleasi sono strettamente regolate da una rigorosa specificità del substrato, localizzazione confinata o da potenti inibitori per evitare la degradazione indesiderata o incontrollata del DNA e dell’RNA cellulare.
Modalità di azione delle nucleasi
I prodotti di scissione della nucleasi del DNA e dell’RNA sono simili perché entrambi gli acidi nucleici sono polimeri di nucleotidi. I nucleotidi, che sono gli elementi costitutivi degli acidi nucleici, sono composti da una base purinica ovvero adenina o guanina oppure pirimidinica ovvero citosina o timina nel DNA e citosina o uracile nell’RNA.
La base è legata a uno zucchero ovvero desossiribosio nel DNA o ribosio nell’RNA mediante un legame N-glicosidico e lo zucchero viene fosforilato nella posizione 3′ o 5′. Il DNA è un polimero di nucleotidi di desossiribosio e l’RNA è un polimero di nucleotidi di ribosio.
I nucleotidi sono uniti tra loro da legami fosfodiesterici che legano il gruppo 5′-fosfato di un nucleotide al gruppo 3′-idrossile (-OH) del nucleotide adiacente. Si ritiene che la scissione dei legami fosfodiesterici avvenga mediante una catalisi acido-base, in cui la base attiva il nucleofilo mediante deprotonazione e l’acido facilita la formazione del prodotto protonando il gruppo uscente.
Nucleofili
Le nucleasi utilizzano una varietà di nucleofili per scindere un legame fosfato. I nucleofili più comuni sono molecole d’acqua deprotonate da una base. Per la scissione del DNA, le catene laterali di Ser, Tyr e His fungono da nucleofili per formare un intermedio covalente fosforile-proteina del DNA, che viene successivamente risolto mediante una reazione di trasferimento del fosforile al DNA.
Gli ossidrili 2′ dell’RNA o ribonucleotidi liberi sono nucleofili aggiuntivi utilizzati dalle RNasi. Il gruppo -OH in posizione 2’ adiacente ad un fosfato scissile spesso funge da nucleofilo e porta alla formazione di un fosfato ciclico labile 2′,3′ che viene poi idrolizzato per produrre un fosfato 3′.
La RNasi PH, ovvero la nucleotidiltransferasi del tRNA, e le polinucleotide fosforilasi, enzimi bifunzionali con un’attività fosforolitica utilizzano il fosfato inorganico come nucleofilo per degradare i virus a RNA a singolo filamento mediante fosforolisi e produrre nucleosidi 5′-difosfati
Classificazione
A seconda della loro specificità e del loro meccanismo di azione le nucleasi possono essere suddivise in:
Le endonucleasi o enzimi di restrizione furono scoperte da Werner Arber, Dan Nathans e Hamilton Smith che vinsero il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 1978. Esse scindono il legame fosfodiesterico all’interno di una catena polinucleotidica dividendola in due polimeri, con vari gradi di riconoscimento dei siti.
Forniscono i “coltelli chimici” per tagliare i geni in frammenti definiti che possono poi essere utilizzati per determinare l’ordine dei geni sui cromosomi, per analizzare la struttura chimica dei geni e delle regioni del DNA che regolano la funzione dei geni e per creare nuove combinazioni di geni
Le esonucleasi sono enzimi chiave coinvolti in molti aspetti del metabolismo e del mantenimento cellulare e sono essenziali per la stabilità del genoma, che rimuovono i nucleotidi dall’estremità della catena di DNA o RNA, spezzando il legame fosfodiesterico finale e vengono utilizzate per degradare selettivamente il DNA a filamento singolo.
Le DNasi, o desossiribonucleasi, sono selettive nei confronti del DNA anziché dell’RNA e diverse varietà possono tagliare dall’interno o dalle estremità. La DNasi viene spesso utilizzata nella ricerca per rimuovere il DNA contaminante da campioni di RNA e proteine, pulire colture cellulari ed eseguire esperimenti di frammentazione del DNA.
Le RNasi o ribonucleasi sono un ampio gruppo di enzimi idrolitici che degradano l’RNA e sono selettive nei confronti dell’RNA rispetto al DNA. Esse catalizzano l’idrolisi dell’acido ribonucleico operando a livello di trascrizione e traduzione . Vengono spesso utilizzate per rimuovere l’RNA contaminato dai campioni e dai test dell’RNA.
