Marcamento isotopico: applicazioni, identificazione delle proteine

Con la tecnica del marcamento isotopico si può osservare dove e in quale dei prodotti di reazione è presente l’isotopo e ipotizzare di conseguenza il meccanismo.

In un composto marcato isotopicamente un singolo atomo è sostituito da uno dei suoi isotopi ed è usato quale reagente in una reazione chimica. Tale isotopo può essere individuato e localizzato nei prodotti di reazione ed eventualmente anche nell’intermedio con specifici metodi analitici.

Applicazioni del marcamento isotopico

In chimica organica e in chimica biologica sono abitualmente usati quali isotopi il deuterio ²H, il tritio ³H, gli isotopi del carbonio ¹³C e ¹⁴C, l’isotopo dell’azoto ¹⁵N e dell’ossigeno ¹⁸O.

Per individuare la presenza di isotopi in una molecola vi sono svariati metodi quali la spettrometria di massa che rileva la presenza dell’isotopo dalla sua massa, la spettrometria I.R. che rileva la differenza dei moti vibrazionali dell’isotopo,  la risonanza magnetica nucleare che rileva gli atomi che hanno diversi rapporti giromagnetici o tramite una camera di ionizzazione  che rileva il decadimento radioattivo.

Un esempio tipico in cui è usato un isotopo marcato è costituito dalla reazione di esterificazione di Fischer, dovuta al chimico tedesco Hermann Emil Fischer, che avviene tra un acido carbossilico e un alcol in ambiente acido.

La reazione può essere schematizzata come segue:

R₁COOH + R₂OH ⇌ R₁COOR₂ + H₂O

Nonostante l’apparente semplicità della reazione si è a lungo dibattuto in relazione al meccanismo con cui avviene.

Per poter avere sufficienti elementi di valutazione si è marcato isotopicamente l’ossigeno dell’alcol al fine di sapere se nel prodotto di reazione l’ossigeno legato a R₂ fosse quello presente nell’acido carbossilico o quello presente nell’alcol.

Si è ottenuto che:

R₁COOH + R₂¹⁸OH ⇌ R₁CO¹⁸OR₂ + H₂O

In cui si comprende che l’ossigeno presente nell’estere è proveniente dall’alcol; ciò indica che avviene un attacco nucleofilo dell’ossigeno dell’alcol al carbonio carbonilico dell’acido e che viene successivamente eliminato l’idrogeno dell’alcol legato all’ossigeno.

Solo da tali considerazioni si è potuto ottenere il meccanismo della reazione che è riportato in figura:

Proteomica

In chimica biologica nell’ambito della proteomica che consiste nell’identificazione sistematica delle proteine e della loro caratterizzazione rispetto a:

• struttura
• funzione
• interazioni molecolari

si ricorre al marcamento isotopico introducendo un isotopo naturale a bassa abbondanza di carbonio, azoto, idrogeno e, in alcuni casi, l’ossigeno, in un peptide o proteina.

Si ricorre in genere alla proteomica comparativa che consiste  nel raffronto tra due campioni di cui uno marcato e l’altro no. I campioni sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa. La determinazione del rapporto tra i due consente un’analisi comparativa delle quantità relative di una data proteina nei due campioni.