Coefficiente di Hill: legame cooperativo

Il coefficiente di Hill è comunemente usato per stimare il numero di molecole di leganti necessarie per legarsi a un recettore per produrre un effetto funzionale.

La funzione e le proprietà di molti enzimi possono essere studiate dall’equazione di Michaelis-Menten.

Vi è, tuttavia, una particolare classe di enzimi che presentano proprietà cinetiche che non possono essere studiate da tale equazione. L’equazione della velocità di tali enzimi è caratterizzata da una curva a forma di sigmoide che differisce da quella della maggior parte degli enzimi che danno curve a forma di iperbole.

I profili cinetici sigmoidali vengono dati da enzimi che mostrano una cooperatività positiva.

La cooperatività si riferisce al fatto che il legame del legando al substrato o un sito di legame influenza l’affinità di altri siti per i loro substrati.

Legame cooperativo

Il legame cooperativo richiede che la macromolecola abbia più di un sito di legame in quanto la cooperatività dipende dall’interazione che si ha tra questi siti. Se l’associazione del legando al primo sito incrementa l’affinità tra gli altri siti ed altre molecole di legando si  ha appunto una cooperatività positiva. Per tali reazioni enzimatiche si verifica un aumento della velocità ad un valore più alto di [S] fin quando non viene raggiunta la massima velocità.

Mettendo in grafico la concentrazione del substrato in ascissa e la velocità in ordinata si osserva l’andamento sigmoidale.

grafico di Hill

Il fenomeno della cooperatività fu osservato nell’interazione tra ossigeno ed emoglobina. La cooperatività positiva implica un’allosteria che è la regolazione di un enzima o di una proteina mediata da una molecola denominata effettore che svolge tale funzione legandosi al sito allosterico. Un effettore è, nella gran parte dei casi, una molecola di piccole dimensioni che si lega selettivamente a una proteina e regola la sua attività biologica. Gli effettori agiscono come leganti che possono aumentare o diminuire l’attività enzimatica.

Il legame dell’effettore presso tali siti modifica la struttura terziaria dell’enzima e quindi varia la sua affinità per il substrato con conseguente aumento o riduzione dell’attività catalitica. Gli effettori possono essere omotropi o eterotropi a seconda che presentino o meno la stessa natura chimica del substrato dell’enzima.

Grado di cooperatività

Il grado di cooperatività è determinato dall’equazione di Hill per cinetiche che non seguono l’equazione di Michaelis-Menten. L’equazione di Hill tiene conto del legame allosterico in siti diversi dal sito attivo ed è espressa dall’equazione:

θ = [L]n/ Kd+ [L]n  = [L]n/ (KA)n+ [L]n

dove  θ si riferisce alla frazione di legando legata ai siti riempiti, [L] è la concentrazione del legando, Kd è la costante di dissociazione apparente ottenuta dalla legge di azione di massa,

KA è la concentrazione del legando necessaria ad occupare la metà dei siti di legame e rappresenta la costante di dissociazione microscopica

n è il coefficiente di Hill che descrive la cooperatività.

Se il coefficiente di Hill è minore di 1 il sistema ha una cooperatività negativa mentre se il coefficiente di Hill è maggiore di 1 la cooperatività è positiva.

 Passando ai logaritmi decimali l’equazione di Hill diventa:

log (θ/ 1 – θ) = n log [L] – log Kd

Modello concertato e modello sequenziale

Vi sono due modelli che illustrano la cooperatività: il modello concertato detto MWC e il modello sequenziale.

In entrambi i modelli le subunità enzimatiche esistono in due conformazioni T ( teso) e R (rilassato) in equilibrio tra loro. Inoltre le subunità R si legano al substrato più rapidamente rispetto a quelle nello stato T. I due modelli differiscono, tuttavia, in relazione all’interazione delle subunità e nella preesistenza di entrambi gli stati.

Nel modello concentrato le subunità enzimatiche le subunità enzimatiche sono legate in modo che la variazione conformazionale di una provochi una variazione anche nelle altre. In tal modo tutte le subunità devono trovarsi nella stessa conformazione. Secondo tale modello, inoltre, in assenza di legandi l’equilibrio favorisce uno dei due stati conformazionali T o R. l’equilibrio può essere spostato se un ligando si lega a un sito diverso da quello attivo ( sito allosterico).

Secondo il modello sequenziale le subunità non sono collegate in modo che la variazione conformazionale di una induca una variazione nelle altre. Per questo modello, quindi, tutte le subunità enzimatiche non hanno necessariamente la stessa conformazione. Inoltre, le molecole del substrato si legano attraverso un adattamento indotto. Quando una subunità collide in modo casuale con una molecola di substrato, il sito attivo forma una sacca intorno al suo substrato. Un tale comportamento mentre converte una subunità dallo stato R a quello T non propaga il cambiamento alle subunità adiacenti ma induce una alterazione nella loro struttura in modo che i loro siti leganti siano più ricettivi per i substrati.

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